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在受精后数小时内通过机械性质预测人卵母细胞发育潜力

时间:2019-04-06 08:43:57  来源:南方39助孕

抽象

在植入前发育期间胚胎停滞的原因知之甚少。由于在这样的早期阶段缺乏可靠性和非破坏性的活力预测因素,阻碍了将卵母细胞基因表达模式与成功的胚胎发育相关联的尝试。在这里,我们报告受精卵粘弹性特性可以预测受精后数小时内人和小鼠的胚泡形成,精确度> 90%,特异性95%,灵敏度75%。我们证明存活和不存活的受精卵的转录组之间存在显着差异,尤其是在对卵母细胞成熟很重要的基因的表达中。此外,我们表明,低质量的卵母细胞可能经历不足的皮质颗粒释放和透明带硬化,导致受精后的力学改变。

介绍

有人认为,胚胎的命运胚胎基因活化(EGA)之前,甚至受精之前在发育早期确定,1,2,3。EGA之前不发生转录,因此胚发生的最初步骤是由从卵母细胞继承母体信息独占控制1,2,3。EGA中涉及的主要转录波在单细胞受精卵中观察到小鼠4中的双细胞阶段和人中的4至8细胞阶段5。在人类中,各种卵母细胞的形态特征6与胚胎发育和植入潜力相关,包括透明带厚度7,粒度8,卵周空间9和卵母细胞形状10。然而,这些标准是高度主观的,其预测价值存在争议11。如果在EGA之前没有可靠的胚胎存活率预测因子,仍然不清楚卵母细胞决定发育潜力的程度。

胚胎由于质量差的卵母细胞发育失败的机制也很大程度上未知。一些研究已经开始从产妇年龄推断质量,探讨在高和低质量的卵母细胞之间的转录水平的差异12,13或套数14。然而,这些卵母细胞质量的测量只能识别所有无活力卵母细胞的亚群,因为在此阶段后可能出现染色体异常,并且母亲年龄不是生存力的完美预测因子。在EGA之前准确且无损的生存能力预测因素将使我们能够全面了解卵母细胞转录组中的缺陷,这可能导致胚胎停滞。

近年来的研究表明,机械投入发挥在分子水平上调节细胞命运和功能的主要作用15,和细胞的内部状态,也可以在其机械性能反映16,17。在小鼠和人类胚胎中,受精期间皮质颗粒的释放导致僵硬的物理变化,这被称为“透明带硬化” 18,这是先前仅在生物化学上描述的过程。胞质内精子注射(ICSI)中的卵母细胞膜到穿刺针的响应被认为是预测胚胎形态和生存的在培养物中19,20。胚胎和卵母细胞的刚度也被关联到怀孕人类,并在小鼠产妇年龄,表明有可能是机械和生存能力之间的联系21,22,23。

In this study, we report a set of mechanical parameters that can be measured nondestructively within hours after fertilization and can identify human zygotes destined to arrest, with >90% precision, 95% specificity and 75% sensitivity (Fig. 1). Using these parameters to stratify embryos by viability, we identify important genes and pathways that play key roles in pre-implantation embryo development, most of which are reflective of oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, DNA repair and cellular stress response. We also show that patterns of gene expression found in non-viable embryos may affect cortical granule release and zona-hardening, which helps to explain the link between embryo viability and mechanical properties.

Figure 1: Overview of experimental design.

(a)我们测量了282只小鼠和89只人类受精卵的机械特性,并发现了最能预测生存力的组合,定义为胚泡期的存活率。(b)然后我们测量了小鼠的活产率,这些小鼠接受了基于力学预测可行的胚胎(n = 55),基于力学预测不可行(n = 55)或随机选择作为对照(n = 55)。(c)我们对17名人类受精卵进行了单细胞RNA-seq,并发现基于力学的预测存活和不存活的转录组之间存在差异。(d我们研究了预测存活的30个胚胎和基于力学预测不可行的37个胚胎之间的皮质颗粒释放的差异。比例尺,40μm。

 

全尺寸图片 结果 Zygote机械参数预测胚泡形成

将来自成功的体外受精IVF)周期的总共89个双原核(2PN)阶段人类受精卵解冻。我们在解冻后3小时内测量了它们的机械参数,并使用延时显微镜(来自Auxogyn的Eeva系统)跟踪它们在5-6天内的发展,每5分钟拍摄一次图像。形成胚泡的那些被指定为存活的。微吸管被选择来探测胚胎的机械性能,因为它是微创,可以快速执行,并已广泛用于研究细胞的粘弹性性质24,25。在图2a中示出了经历抽吸的小鼠受精卵的图像。我们用来模拟胚胎的四参数体积力学模型如图所示图2b ; 它是Zener 26型号,带有额外的粘性元素。在图2c中示出了施加到移液管中的压力的​​示例图(阶梯函数)以及胚胎随时间的抽吸深度以及其与机械模型的拟合。

图2:测量系统的设计以及活的和不存活的胚胎之间的机械参数的差异。

(a)测量技术和(b)用于提取机械参数的机械模型。(c)通过微量移液管(红线)施加于胚胎的压力的典型痕迹以及胚胎吸入微量移液管(蓝线)时胚胎对压力的响应。(d)盒须图(方框显示中位数,边缘位于第一和第三四分位数,因此总盒高度为四分位数间距(IQR),较低的晶须从边缘延伸至1.5 * IQR内的最低值,上部晶须从上边缘延伸到边缘的1.5 * IQR内的最高值,散点图覆盖人类受精卵的机械参数(n = 89)。可存活的受精卵的参数(n = 31)看起来比无活力受精卵的群集更紧密(n = 58)。(e)三个机械参数的三维散点图,显示可存活的人类受精卵(n = 31)在一个区域紧密聚集,其中散布着无活力的受精卵(n = 58)。(f)具有相似形态分数的一些人类受精卵的示例图像,基于力学预测其是可行的或不可行的。(克)机械参数也预测在小鼠活产的,并且使我们能够改进活产率(P = 0.01,χ 2 -test)与一组对照胚胎的(相比Ñ每组= 55,总共四次重复)。* P <0.05,*** P <0.001。误差棒表示sd比例尺,60μm。

 

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图2D的三个四个参数中的节目箱形图(在分离非活来自活胚胎用处的顺序:ķ1,η 1,ķ 0,以η 1对数变换)。对于存活的胚胎参数四分位范围比非存活的胚胎的小,除了第四参数(η 0,补充图1)。图2e中示出了来自图2d的三个参数的散点图。而各个参数如图2d所示当绘制在一起的大多数活的胚胎的散点图(的一个区域群集上自己的,提供有限的预测值ķ 1 = 0.30 n×m个-1,η 1 = 0.59 N s个米-1和ķ 0 = 0.12 N×M个- 1),并没有“典型的”不存活的胚胎。图2f包含来自图2e的胚胎的典型图像,并且显示有活力和无活力的胚胎在发育的这个阶段在形态上几乎无法区分,但具有不同的机械参数。使用图2e中的数据,我们培养了支持向量机(SVM)分类器,以基于那些机械参数可行的和非活的胚胎之间的最佳决策边界,并进行特征选择,以确定三个参数(再次ķ1,η 1和ķ 0)提供了最佳预测值(补充图2C)。接收器操作特性(ROC)和精确调用(PR)曲线显示在补充图2A,B中。当使用我们的分类器根据其机械性质预测人胚胎囊胚形成时,ROC曲线下面积为0.87,PR曲线下面积为0.86,相当于> 90%精度,95%特异性和75%灵敏度。

一旦我们确定我们的机械参数可以可靠地预测受精卵阶段的活力,我们将它们的性能与通常用于在早期阶段预测胚胎活力的其他参数进行比较。对于所有89个人类受精卵,我们通过测量关键切割阶段之间的时间间隔来提取细胞周期参数(补充图3A,B)。我们观察到第一次胞质分裂(c 1),(ii)第一次和第二次有丝分裂(c 2)和(iii)之间第二次和第三次有丝分裂(c 3)之间的时间(以小时计)(i )是(c)1 = 0.20,c 2 = 11.32,c 3对于发育到胚泡期的胚胎(89个中的31个),这与之前的报告重叠27。被捕的胚胎具有各种各样的参数。当这三个参数用于预测胚泡形成时,敏感性和特异性分别为85%和88%,AUC ROC为0.95和AUC PR0.91。尽管与四细胞阶段的细胞周期参数相比,单独的机械参数具有略低的预测能力,但它们目前代表了在胚胎达到三至四个细胞之前预测生存力的最有效方法。特别是,在受精卵阶段,只有机械参数可以提供有关胚胎活力的信息,并且需要额外48小时的培养时间推移参数以超过其预测能力(补充图3D)。机械参数也可以单独改善细胞周期参数的预测值(补充图2A,B); 的机械和细胞周期参数(最佳组合ķ 1,η 1,Ç1和c 2)可以实现90%和91%的灵敏度和特异性,AUC ROC为0.97,AUC PR为0.94(补充图2D,四细胞阶段)。

Zygote机械参数还可以预测小鼠的活产

除了使用小鼠作为模型的体外胚泡形成之外,我们还研究了胚胎机械性质是否可预测体内发育。首先制作分类器用于预测小鼠胚胎生存力,因为它是为人类胚胎制造的。简而言之,我们在2PN阶段测量了总共282个小鼠受精卵的机械性质,然后在体外培养它们以基于胚泡发育确定良好或差的发育潜力。仅选择用两个极体受精的胚胎进行测量。三个最重要参数的散点图显示在补充图4中。我们测量机械性能的胚胎与对照胚胎(70%)没有显着不同的胚泡形成率(67%)(补充图5),表明测量不会降低小鼠胚胎活力(P = 0.62,两个 -比例z-测试)。如同人类胚胎,即达到胚泡期的小鼠胚胎占用周围散点图的一个区域(ķ 1 = 0.17 n×m个-1,η 1 = 1.3 N s个米-1和ķ 0 = 0.06 N×M个-1),而无活力的胚胎则从“平均”活胚胎中分散开来。我们在小鼠数据上训练了SVM分类器,发现机械参数可以通过受精阶段预测胚泡形成,AUC ROC为0.85,AUC PR为0.92,相当于76%的灵敏度和79%的特异性。

在分类器验证后,测量204个小鼠受精卵的机械参数并根据其机械特性进行分组。在测量和分析后2小时内将总共55个活的胚胎和55个无活力的胚胎转移到受体雌性小鼠中,使得每只小鼠接受12-15个胚胎,其全部存活或全部无活力。实验结果显示在补充表1中通过小鼠和实验(总共四次实验)分解,并且作为整体在图2g中显示。基于力学分类为可行的胚胎显著(P <10 -6,χ 2-test)更可能导致在与分类为基于力学(24%)非存活的胚胎相比,活产(74%),并且它们也显著(P = 0.01,χ 2 -test)更可能导致在活产中,比通过形态学选择的对照胚胎(49%)。这表明机械参数是小鼠最终存活潜力的真实指标,我们的测量不会影响胚胎发育。尽管小鼠和人类之间胚胎逮捕的原因可能不同,因此小鼠模型的结果可能并不总是转化为人类,但我们发现这些结果令人鼓舞。未来的研究将揭示人类胚胎的机械特性是否也能预测临床怀孕和活产。

人类受精卵基因表达与生存力相关

在验证了我们的机械参数的预测能力后,我们询问发育潜力是否反映在转录水平上,如果是这样,基因表达的哪种模式是有活力或无活力受精卵的特征。我们在2PN阶段测量了22个先前冷冻的人类受精卵的机械参数,其基于其机械参数被分类为存活的或不存活的。仅选择具有另一个“同胞”胚胎的胚胎进行测序以解释后处理中的患者间变异性。对剩余的17个单胚胎进行单细胞RNA测序(RNA-seq),产生441-Gb数据,每个胚胎(平均)有3100万对末端读数,读取长度为100bp。我们检测到12,342个基因的表达,其中1个,q值低于1%。基因表达的所有“显着”差异具有q值<0.01作为R中的edgeR 28包的输出。图3a显示了去除批次效应后基因表达数据的分级聚类。正如所料,胚胎通过预测的生存力聚集。图3b显示了前三个主要组件的图,捕获了数据集中90%的变化。同样,有活力和无活力的胚胎看起来分离良好,第一主成分捕获大部分变异。树形图和主成分图均基于表达值大于0.5百万分之一的所有基因制成。图3c 图1显示了活细胞和非活细胞胚之间表达的对数倍变化的散点图,相对于每个基因的每百万表达计数(cpm)的对数作图。

图3:8种预测的活的和9种预测的无活力的人类受精卵的RNA-seq结果(基于力学预测)。

(a)基因表达值的分层聚类表明受精卵是通过活力聚类的。在总共两次重复中使用N = 8个存活和n = 9个无活力的受精卵。(b)3D主成分图还显示受精卵按生存能力聚类。(c)使用R中的edgeR包,我们发现2,522个基因在活的和不存活的胚胎(蓝色圆圈)之间的表达中具有统计学上显着的(q值<0.01)差异,其中大多数具有对数倍变化。至少0.5。(d我们发现许多基因类别的差异在卵母细胞成熟和受精中很重要。此处显示了包含特别感兴趣的基因表达的中值和IQR的箱形图。晶须从盒边缘延伸至IQR的1.5倍,如图2d所示。(e)IPA预测非存活胚胎中细胞周期检查点控制和染色体分离显着减少(P<0.01)。(f)预测相互作用的基因网络(P <0.01),其参与染色质修饰,这是对卵母细胞到胚胎转变很重要的过程。

 

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我们进一步检查了RNA-seq数据,以确定哪些生物过程(BP)可能受到DE基因的影响,并研究为什么无活力的胚胎注定要停止。我们使用数据库注释,可视化和集成发现(DAVID)工具在我们的DE基因列表上执行基因本体聚类,并确定是否有任何分子功能或BP过度表示。表1显示了19个功能注释簇的列表,每个簇中至少有一个组件包含调整后的P值(q - 值)低于0.05,以及其浓缩分数。然后,我们使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)来检查有活力和无活力胚胎之间基因表达差异的预测生物学效应,并鉴定共同调节基因的网络。

表1:差异表达基因的基因本体分析。全尺寸表

表1中的簇4,10和17 涉及核成熟中涉及的过程。图3d包含来自这些簇的所选基因的箱形图,其是活的和不存活的胚之间的DE。特别地,我们发现无活力的胚胎具有减少的基因表达,包括细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1),这对哺乳动物的有丝分裂细胞周期调节至关重要29,生发泡破裂和减数分裂恢复30,并且表达低两倍在无活力的胚胎中。同时,我们发现CDC25B的表达差异为1.3倍,这对于CDK1是必不可少的。激活。我们还发现了许多细胞周期蛋白和其他细胞周期蛋白依赖性激酶的表达变化,包括CDK2,CDK4和CCNA2,它们在调节细胞周期和卵母细胞成熟中都很重要。我们的研究还揭示了参与染色体分离和倍性状态调节的73个基因的表达差异。我们发现BUB1,BUB1B,BUB3,MAD2L1,securin(PTTG1和PTTG2),后期促进复合物(ANAPC1,ANAPC4和ANAPC11)成员,染色体蛋白(SMC2,SMC3和SMC4)和DNA的结构维持表达差异拓扑异构酶(TOP1,TOP2A和TOP2B)。减数分裂标记基因SYCP3在非存活胚胎中也显示为DE。

然后我们使用IPA来预测我们的差异表达模式对细胞周期进展和非整倍性预防的影响。该分析的结果(图3e)表明,无活力的胚胎具有降低的进行细胞周期检查点控制,染色体比对和染色体会聚的能力(蓝线表明该基因的表达与预测的效果和黄线一致)表明它不同意)。

Clusters 1, 7, 12 and 18 in Table 1 are related to epigenetic modification of chromosomes and regulation of gene transcription. We found significant differences in expression of 161 genes involved in chromatin remodelling, some of which are plotted in Fig. 3d. Specifically, we found differences in expression of DNMT3B, HDAC1, TET3 and YY1. Loss of any of these genes results in embryonic lethality or a higher rate of developmental failure due to aberrant epigenetic modifications31,32,33,34. Figure 3f shows an interaction network (P<10−32) calculated with IPA that includes genes involved in chromatin modification, coloured by the log-fold change between viable and non-viable embryos. IPA analysis also predicted that chromatin organization and modification activity was reduced in non-viable embryos based on the log-fold change in gene expression we found between viable and non-viable embryos (Supplementary Fig. 6).

表1中的簇2 指的是胚胎修复其DNA的能力,这意味着DNA损伤可能是胚胎逮捕的另一种可能机制。我们发现参与DNA修复和端粒维持的许多基因的表达存在差异,包括BRCA1,TERF1,ERCC1,XRCC6,XAB2,RPA1和MRE11A。对我们的数据进行IPA分析还发现,在我们的无活力胚胎中DNA修复减少(补充图7),并且无活力的胚胎更可能具有不良的胚泡形态(补充图8)。

表1中的簇3,8,11,14,16和19 涉及蛋白质合成,修饰,定位和降解,所有这些对于卵母细胞中的适当细胞质成熟和受精后的适当发育是至关重要的。在这些中,数个(ATG5,CUL3,USP11,USP2和UBE2G2)是公知的蛋白质的泛素化和自噬到起到至关重要的作用,和功能丧失是具有植入前逮捕和胚胎致死协会35,36,37。这些结果强化了这样一种观点,即母体转录本的及时降解对于确保胚胎在EGA后能够成功发育至关重要。

无活力的卵母细胞可能受到次优的受精

我们的人类RNA-seq数据表明,在存活和不存活的胚胎之间可能存在许多对受精很重要的基因的差异表达(图4a)。其中,CD9,ZP3和ZP4存在于卵子的质膜和透明带(ZP)中,如果表达不正确,可能会抑制精卵结合。有趣的是,我们发现在无活力的受精卵中PLCZ1水平降低,这是一种编码精子蛋白的mRNA。我们还发现在IP的非成活受精卵表达减少3受体ITPR1,这是启动钙重要2+振荡,导致皮质颗粒释放和透明带硬化。

图4:皮质颗粒染色揭示了基于力学的预测的活的和不存活的胚胎之间的受精之间的差异。

(a)在RNA-seq结果中鉴定为差异表达的一些对受精重要的基因列表。(b)用于皮质颗粒染色的小鼠胚胎的代表性图像。(c)无活力胚胎的皮质颗粒信号较高,无论它们是否过于柔软(n = 24,P <10e-6,Wilcoxon秩和检验)或过于僵硬(n = 13,P <10e-5) ,Wilcoxon秩和检验)与活胚胎相比(n = 30)。*** P <0.001。(d)卵母细胞中IP 3受体的阻断(n与受控胚胎(n = 19)相比,受精前受精后的力学结果略微变软,并且没有非常僵硬的胚胎。(e)与对照胚胎相比,注射抗体的胚胎的最硬四分位数与对照注射胚胎的最硬四分位数(P = 0.02,Wilcoxon秩和检验)和未释放的皮质颗粒的亮度(任意单位)相比,IVF后刚度降低具有相似的力学性能(P <0.01,Wilcoxon秩和检验)。(f)在从GV(n = 35)到MI(n)的成熟过程中,卵母细胞变得不那么僵硬(P <10e-7,Wilcoxon秩和检验)= 49)到MII(n = 65)阶段。误差条表示sd。比例尺,25μm。

 

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为了测试皮质颗粒胞吐作用的程度是否是胚胎机械性质的差异,我们根据IVF后的机械特性将小鼠受精卵分类为活的或不活的,然后使用共聚焦显微镜对保留在细胞质内的皮质颗粒进行成像。所有可存活的受精卵(n = 30)具有低水平的信号,而大多数无活力的受精卵(n = 37)具有非常明亮的信号(图4b)。使用Wilcoxon秩和检验,我们发现这种强度分布的中值在非生存胚胎中要高得多,无论它们是否具有较低的(n = 24,P <10 -6)或更高的刚度(n = 13) ,P <10 -5)比活胚胎(n = 30; 图4c)。这些结果表明皮质颗粒胞吐作用可以影响胚胎僵硬,但也有可能解释胚胎力学和生存能力之间联系的其他因素。

我们接下来微注射的卵母细胞(Ñ = 32)与抗体的IP 3受体(ITPR1)到框皮质颗粒释放和受精后观察胚胎刚度的变化。我们还对19个对照胚胎进行了假注射。显微注射不会抑制精子穿透,因为在授精后37%的注射和40%的非注射卵母细胞中可以观察到两个原核。然而,抗体的引入使对照胚胎的胚胎僵硬度从0.143±0.022 N m -1降低至0.135±0.012 N m -1(P = 0.12,Wilcoxon秩和检验; 图4d))。尽管注射抗体不会引起平均硬度的统计学显着变化(双侧t检验),但刚度值的分布存在统计学上显着的变化(P = 0.03,双样本Kolmogorov-Smirnov检验) 。抗体注射胚胎的最硬四分位数显着较软(P = 0.03,Wilcoxon秩和检验),并且与对照注射胚胎的最硬四分位数相比,来自皮质颗粒的信号显着更高(P = 0.03,Wilcoxon秩和检验),表明皮质颗粒释放较少(图4e)。与具有相似机械参数的一组胚胎相比,它们还表现出显着更少的皮质颗粒释放(P = 0.008,Wilcoxon秩和检验; 图4e)。最柔软的四分位抗体注射胚胎似乎未受影响,因为它们没有表现出来自最软的四分位对照胚胎的显着不同的硬度(P = 0.73,Wilcoxon秩和检验)和皮质颗粒释放(P = 0.06,Wilcoxon秩和检验)。 (图4e)。

我们还发现卵母细胞硬度在成熟过程中显着下降(从GV到MI的P <10 -5,从MI到MII的P <10 -9,Wilcoxon秩和检验)。随着卵母细胞的成熟,它们变得更柔软; GV期(n = 35),平均卵母细胞硬度为0.083±0.013 N m -1,MI期(n = 49)为0.070±0.008 N m -1,MII期为0.056±0.013 N m -1(n = 65; 图4f)。在收集GV和MI卵母细胞之间经过大约5-6小时,在收集MI和MII卵母细胞之间经过12-15小时,表明卵母细胞在生发泡破裂后经历快速软化,其在MI和MII阶段之间减慢。我们的研究结果表明,无活力的胚胎表现出多种机械表型,可能反映出完成胚胎发生的能力降低。这些力学差异可能是由受精前卵母细胞软化和成熟异常引起的,也可能是受精时皮质颗粒胞吐作用的能力引起的。

讨论

我们首次展示了一种在2PN阶段准确评估人类胚胎活力的技术,而合子基因组在转录上无活性,并且发育仍受母体mRNA和蛋白质的控制。在这样的早期阶段预测胚胎存活力的能力强烈地表明在受精前卵母细胞的内容物确定了大部分人胚胎发育潜力。尽管精子中的DNA片段化或损伤会降低健康卵母细胞的发育潜力,但是卵母细胞是绝大部分细胞质内容的贡献,这对成功的发育也至关重要。提出的胚胎存活力测定模型如图5所示。

图5:确定胚胎命运的模型以及机械可检测的原因。

由于成熟过程中的外部应力或固有的低质量,一些卵母细胞未能达到最佳成熟。在受精时,这些卵母细胞(蓝色细胞质)可能过于僵硬并且仍然不成熟,或者它们可能无法适当地释放皮质颗粒并且在受精后过度柔软。最佳成熟的卵母细胞(绿色细胞质)将皮质颗粒释放到卵周细胞空间,经历适当的机械性质变化并继续成功发育。

 

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以前的许多研究都集中在卵母细胞和胚胎质量评估,以及如何确定胚胎命运。特别地,已经提出前两个胚胎细胞分裂主要由母体基因38控制,并且在小鼠中,胚胎中的第一个分裂影响随后的发育39。在小鼠卵母细胞,如基因敲除实验斯特拉和HSF1已经允许卵母细胞基因的鉴定,在胚胎发育中发挥着重要作用40,41。最近,单个人类胚胎上的RNA-seq揭示了阶段特异性转录本,并提供了哺乳动物植入前发育中重要候选物的景观27,42,43 ; 但是,很少有受精卵数据可用。我们的数据提供了高低发育潜力的受精卵转录组差异的全局视图。

我们发现无活力胚胎表现出显着不同的控制细胞周期进程的基因表达,包括几乎所有细胞周期蛋白依赖性激酶和许多细胞周期蛋白。这些差异意味着非可行的胚胎可能无法恢复受精的细胞周期,并可能有助于解释为什么第一次细胞分裂的时间可以预测胚泡形成27,44。我们还发现,无活力的胚胎misexpress基因在姐妹染色单体凝聚,排列或分离,或在纺锤体装配检查点中很重要,这可能有助于解释在被捕的人类胚胎中看到的高水平的非整倍性45。我们的数据还表明,与老年卵母细胞非常相似,无活力的受精卵在DNA修复和端粒维持方面存在显着缺陷。有趣的是,即使我们除去在我们的数据间差异,我们还是发现了基因表达模式在我们的非成活受精卵是类似于那些年龄卵母细胞的46,47。我们的研究结果表明,患者的生存能力存在异质性,其中无活力的受精卵可能比活的受精卵“老化”得更快。

我们的研究结果还表明,无活力的受精卵也存在细胞质成熟缺陷,这可能会削弱它们从母体转变为合子控制并在受精后成功发育的能力。虽然核成熟是由细胞周期进展定义的,并且可以通过简单的观察容易地评估,但是由于缺乏早期生存力预测因子,因此定义成功细胞质成熟的因子仍然很难表征。逆转录酶PCR为基础,对母体转录物基于微阵列的分析已经鉴定了许多在卵母细胞中表达,并且是用于卵母细胞的发育和成熟的重要基因的48,49。该研究有助于更好地定义转录组水平的细胞质成熟,并且代表了对母系遗传基因表达模式如何与源自MII卵母细胞的受精卵的发育潜力相关联的第一次见解。

我们的RNA-seq数据还显示,无活力的胚胎可以抑制几个参与受精的基因,这些基因可能会损害皮质颗粒释放和透明带硬化,从而影响胚胎的机械表型。特别地,无活力的胚胎显示ITPR1的表达降低,ITPR1是受精引起的信号级联中涉及的受体,并且在卵母细胞成熟期间表现出增加的表达。ITPR1水平不足表达可能影响卵母细胞活化,皮质颗粒释放,因此影响胚胎的机械特性。我们的数据表明,至少有两种机制可以使无活力的胚胎从活胚胎中发展出不同的机械特性。第一种可能是未能将皮质颗粒释放到卵周细胞空间并经历足够的透明带硬化,这可能是由于在受体 - 信号传导途径中上游基因的错误表达引起的,如RNA-seq结果中所见。第二种可能是在受精前实现适当成熟的失败,导致过度僵硬的卵母细胞变成过度僵硬的胚胎。这些结果表明,胚胎的机械特性可以让我们深入了解卵母细胞成熟的质量和胚胎发育能力。50,应在人卵母细胞中进行后续研究,以了解卵母细胞成熟,皮质颗粒释放和胚胎机械特性之间的联系。在今天的IVF诊所中,仅通过寻找缺乏生发泡和极体的存在来评估卵母细胞成熟。因为我们发现卵母细胞的机械特性在成熟过程中发生了变化,所以在这个领域的进一步工作可以产生一种微创的卵母细胞成熟测量,其分辨率比单独的形态学评估更精细。

我们在本研究中使用的微量移液器抽吸方法在测量四个机械参数方面简单有效,其中三个可预测胚胎存活力。这种方法的一个限制是它依赖于整个胚胎的整体模型,其缺乏模型参数和胚胎组分之间的精确对应。如果需要更精细的空间分辨率来测量机械性能,则应使用另一种方法,或者除了进入微量移液管的细胞抽吸深度外,还应测量更多的输出。我们方法的另一个潜在限制是潜在的大(〜30%)变形应用于胚胎。虽然较大的变形被ICSI中常规应用,研究已经表明,施加机械应力到细胞可改变基因表达的水平51,52,诱导肌动蛋白聚合53甚至影响生存力54。我们测量的小鼠胚胎仅变形几秒钟,没有表现出较低的胚泡形成率,并且似乎在几分钟内恢复到其原始形状; 然而,大量的变形仍然可能对基因表达和未来发展产生未知的影响。

本文中使用的改进的齐纳模型代表了整个胚胎机械性能的大量测量。尽管2PN胚胎是机械异质结构,但我们可以使用微量吸管吸取25的综述,使用等式(5)估算小鼠胚胎的杨氏模量为~ 0.5kPa 。此值是类似于那些缺少ZP但展现出固体状的行为,如内皮细胞和软骨细胞的细胞的24,55。一些最近的研究都集中在测量2PN胚胎ZP的杨氏模量和获得的值周围20-40千帕(参考文献18,22,56,57)在小鼠和84千帕(参考文献。58)在牛。总之,这些结果表明胚胎是机械异质结构,其由被硬ZP包围的相对柔软的细胞组成。未来的研究可以研究细胞和ZP力学对大量胚胎力学和发育潜力的相对贡献。

尽管本研究中使用的所有小鼠胚胎都是新鲜的,但人类胚胎先前已进行冷冻保存,已显示其影响透明带硬度59和皮质颗粒胞吐60。在我们自己的数据中,我们发现冷冻保存确实导致胚胎僵硬度立即增加,但这种效应在解冻后3小时消失(补充图9)。因此,为了消除由于冷冻保存引起的潜在混杂效应,我们允许所有人类受精卵在解冻后在培养箱中恢复3-4小时。还已经提出,ICSI和体外培养条件可影响皮质颗粒胞吐作用和胚胎机械特性61,62。在这项研究中,我们无法获得有关受精方法(ICSI / IVF)或冷冻前培养条件的信息,这可能降低了我们人类受精卵活力分类器的预测能力。

我们预测胚胎活力的方法的一个优点是我们的模型适用于小鼠和人类胚胎,尽管它们有许多不同之处。除了缺乏与人类胚胎相同的染色体异常倾向外,小鼠胚胎的机械性也不同; 他们的ZP尺寸要小得多,而且它们具有很高的弹性,使得ICSI具有挑战性63。在我们的数据中,我们发现小鼠胚胎比人类胚胎具有更低的硬度和更高的粘度,这可能有助于解释为什么ICSI在小鼠中如此困难。

使用SVM构造分类器的一些限制是其对箱约束c和径向基函数(RBF)参数σ的敏感性,以及对高维问题的大量训练数据的需求。为c选择错误的值并且σ可能导致数据不合适并且获得较差的分类准确度,或者过度拟合数据并且对异常值过于敏感。为了避免这些情况,我们采用了一种使用10倍交叉验证的优化算法来选择最大化分类精度并避免过度拟合的参数值。在这项研究中,高维度不是问题; 然而,如果我们的模型扩展到包含更多参数,则必须测量更多胚胎以有效地训练分类器。经过适当的参数调整和训练,我们的分类器表现良好; 尽管有活力胚胎与无活力胚胎的分布在小鼠和人类数据之间有所不同(图2e和补充图4)),我们发现由于使用了RBF内核,我们的分类器非常准确并且可以适应两种数据集。我们的机器学习方法的灵活性表明我们的分类器可以应用于多个不同的物种,或者可以通过来自卵母细胞或新鲜人类胚胎的机械数据进一步增强。

在受精后直接准确预测胚胎活力的能力也可在IVF临床中立即应用。传统上,胚胎选择包括形态学评估,这是非常主观的。非侵入性延时成像和胚泡培养技术的发展有助于改善胚胎选择并减少转移胚胎的平均数量。然而,虽然细胞周期参数是稍微更有效,在有机械参数进行比较预测胚泡形成,在培养物中延长的时间是有压力的胚胎,并且可以带负对表观重编程产生影响64,65。我们开发的机械参数有望进一步改善IVF的临床实践,因为一旦受精完成,它们就可以以完全自动化和微创的方式进行测量。在短期内,它们可用于为当前的胚胎选择技术(如细胞周期参数)增加预测价值,并使临床医生能够更自信地转移单个胚胎。然而,在进一步验证后,我们期望它们能够在受精后直接转移胚胎,使胚胎在其自然环境中开始发育。由于机械参数可以在任何发育阶段进行测量,我们的工作也为更好地评估卵母细胞质量和成熟打开了大门,这可以提高诊所的卵母细胞培养,处理和受精率。

方法 人体样本来源

本研究中使用的总共133个2PN阶段人类胚胎来自斯坦福大学RENEW生物库,并获得书面知情同意,他们捐赠用于非茎干研究。所有胚胎在合子或2PN阶段冷冻,这些胚胎很可能代表典型的IVF群体,因为它们在冷冻保存前未被选择。根据斯坦福大学机构审查委员会批准的“RENEW Biobank”协议进行去识别。没有受保护的健康信息与胚胎相关。在解冻的133个胚胎中,91个在解冻后出现活着,其余的被排除,因为它们明显不存活(在任何微量吸管之前)。另外两个胚胎被排除在我们的数据之外,因为它们在微量吸管抽吸过程中受到结构性损伤,并且由于ZP破裂,在我们的数据集中留下了89个人类胚胎。将这89个人胚胎解冻并在六个单独的实验过程中以较小的组进行测量。

人类胚胎培养

人类胚胎使用如前所述一个Quinn的优势解冻工具包(CooperSurgical)解冻26,27。简言之,将冷冻管或吸管从液氮罐中取出并暴露在空气中,然后放入37℃的水浴中。解冻后,将胚胎在0.5和0.2M蔗糖解冻培养基中于37℃温育10分钟。然后将胚在37℃解冻稀释液中洗涤,并在补充有10%血清蛋白替代物(CooperSurgical)的Quinn优势切割培养基(CooperSurgical)中培养3-4小时。在一些实验中,使用Eeva系统(Auxogyn)监测胚胎的发育。

小鼠胚胎和卵母细胞收集和IVF

杂交菌株(C57B6xDBA2)F1小鼠(4-6周龄雌性)购自Jackson Laboratory并保持在Lorry Lokey干细胞研究大楼的动物设施中。所有实验均在Institutional Animal Care and Use Committee方案#16146下进行,该方案得到斯坦福大学实验动物管理管理委员会的批准。简而言之,通过腹膜内注射10IU妊娠母马血清促性腺激素(PMSG,Sigma)10IU人绒毛膜促性腺激素(hCG,Sigma)来超级雌性小鼠。在将一只雌性与相同菌株的8-10周龄雄性交配后,将卵丘 - 卵母细胞复合物从输卵管收集到M2培养基(Millipore)中,并在透明质酸酶(Sigma)中除去卵丘细胞并在M2培养基中洗涤。机械测量后,将胚胎在具有10%血清蛋白替代物(CooperSurgical)的Quinn优势切割培养基(CooperSurgical)中培养。为了测量卵母细胞成熟对力学的影响,在成熟的不同阶段收集卵母细胞。注射PMSG后48小时收集GV卵母细胞。PMSG注射后约48小时,注射hCG。在hCG注射后5-6小时收集MI卵母细胞,并在hCG注射后18-20小时收集MII卵母细胞。

胚胎被排除在我们的数据之外,如果它们显示出非常差的形态,如果它们来自产生少于10个胚胎的小鼠,或者它们是在IVF之后少于40%的胚胎显示原核形成的组中。如果小鼠产生的胚胎太少或受精率太低,我们认为实验方案的某些部分(激素注射,培养基等)必须对胚胎产生负面影响,因此它们可能不能代表正常的小鼠胚胎。 。为了将胚胎分选成对照组和测量组,将它们随机分开,同时在足够低的放大倍数下观察,使得形态难以区分。在每个实验中只有少数胚胎作为阴性对照,在所有实验中总计为35(补充图5))。动物实验的样本大小部分取决于达到统计显着性所需的数据量,部分取决于具有类似研究的出版物中的样本量。在15个单独的实验过程中收集我们测量的282个小鼠胚胎的机械和胚泡形成数据(补充图4和补充图5)。

显微注射小鼠卵母细胞和IVF

在该实验中使用来自Jackson Laboratory的CBA小鼠品系。在诱导4-6周龄雌性小鼠超数排卵后,收集中期II-捕获的卵母细胞并除去卵丘细胞。卵母细胞,然后用显微注射〜以1mg ml的浓度为10pl单克隆抗体18A10(Abcam公司)的-1。将一些卵母细胞保持为阴性对照并且进行假注射或根本不进行注射。然后在常规IVF之前将卵母细胞培养1小时。从8-10周龄的CBA雄性(杰克逊实验室)收集精子,并在授精前使其在HTF培养基(CooperSurgical)中获能45分钟。将适量的精子悬浮液加入到培养卵母细胞的培养基液滴中。没有样品被排除在该实验之外,并且将卵母细胞分类为对照组与测量组,而不考虑形态学和随机顺序。

胚胎力学性能的测量

使用自动微量吸管抽吸系统测量胚胎,并使用定制的光学显微镜记录抽吸的视频。光学显微镜是用Thorlabs的部件制造的,它使用了一个×20,0.4数值孔径的Olympus物镜和白色发光二极管照明。为了进行测量,将每个胚胎置于其自己的一滴培养基中,并将微量移液管放入滴中。用移液管操纵胚胎,使极体背向移液管开口。未能控制测量位置可能会使我们的结果混乱,因为在oolemma和ZP之间有一个靠近极体的空间,而这个perititelline空间在胚胎的其余部分周围要小得多。66 ; 因此,我们注意测量与极体相对的胚胎末端,极体通常靠近纺锤体。

用于测量小鼠胚胎的微量移液管的内径为40μm(Origio MBB-FP-L-15); 人胚胎的内径为70微米,由Origio定制。施加-0.03psi的保持压力以保持胚胎并密封移液管开口。然后,对胚胎施加-0.345psi的阶跃压力。使用闭环PID控制系统施加所需压力。线性致动器(Firgelli L12)移动1毫升注射器的塞子,传感器(霍尼韦尔SSCSNBN010NDAA5)测量压力。它们通过Arduino Uno微控制器连接到计算机,该微控制器可以中继传感器读数并实时向执行器发出命令。使用CMOS相机(Thorlabs DCC1545M)以75 fps记录吸气视频。所有硬件均使用定制的Labview软件(National Instruments)进行控制。使用自动定制的Matlab程序(Mathworks)来提取胚胎的抽吸深度并将其与机械模型相匹配。Canny边缘检测和阈值处理用于识别移液器角落和开口。基于互相关的模板匹配用于随时间自动跟踪胚胎边缘以消除手动测量的偏差。在测量胚胎机械参数期间,研究者不知道它们是否存活至胚泡期,或者它们属于哪一组(在显微注射实验的情况下)。Canny边缘检测和阈值处理用于识别移液器角落和开口。基于互相关的模板匹配用于随时间自动跟踪胚胎边缘以消除手动测量的偏差。在测量胚胎机械参数期间,研究者不知道它们是否存活至胚泡期,或者它们属于哪一组(在显微注射实验的情况下)。Canny边缘检测和阈值处理用于识别移液器角落和开口。基于互相关的模板匹配用于随时间自动跟踪胚胎边缘以消除手动测量的偏差。在测量胚胎机械参数期间,研究者不知道它们是否存活至胚泡期,或者它们属于哪一组(在显微注射实验的情况下)。

单细胞胚胎的力学模型

使用改进的线性弹性固体模型(改良的齐纳模型)来表示胚胎被吸入微量移液管中。假设施加到胚胎的力的阶跃输入,吸气深度随时间的方程是:

哪里

基于对响应动力学的视觉检查,选择改进的齐纳模型而不是其他常用的粘弹性模型,例如Maxwell,Kelvin-Voigt和Zener(标准线性固体)。我们在实验中观察到胚胎对阶梯压力输入的响应是瞬间伸长,然后是指数衰减分量(倒置使变形随时间增加),最后以恒定速率变形,如图2c所示。

麦克斯韦体由弹簧和缓冲器串联组成; 因此,它对阶梯压力的响应是瞬间伸长,然后是稳定的线性变形。由于我们的数据显示了明确的指数成分,因此该模型被认为不足以描述我们的系统。Kelvin-Voigt车身由弹簧和缓冲器并联组成; 因此,它对阶梯压力的响应是衰减指数,其中吸气深度落在最终的最大深度上。该模型未能捕获胚胎经历的瞬时伸长以及指数成分沉降后的线性变形率。齐纳模型在麦克斯韦体上增加了一个额外的弹簧,其对压力的响应类似于Kelvin-Voigt体,但在首次施加压力时具有瞬间伸长。仍然,

五种不同模型的拟合误差的比较显示在补充图10中。我们的模型(有4个参数)似乎是合适的,因为它的误差几乎与五参数模型的误差一样低,有或没有不必要的额外参数。因此,我们认为我们的模型准确地描述了数据而没有过度拟合。

评估胚胎存活力和细胞周期参数

当构建分类器以基于力学区分活的和不存活的胚胎时,囊胚形成被用作生存力的代表。该分类器在小鼠中得到验证,如图2中的活产实验所示。在第1天测量胚胎机械参数后,将胚胎在Auxogyn Eeva系统内培养5-6天,每5分钟捕获一次。从得到的视频中提取细胞周期参数27,并且在第5天(小鼠)或第6天(人)形成胚泡的胚胎被归类为存活。

胚胎活力预测

使用胚泡存活作为基础事实信息,用于训练分类器以基于第1天机械测量来预测胚胎存活力。在胚胎机械参数上训练具有RBF核的二元SVM分类器。使用10倍交叉验证选择框约束(c)和RBF西格玛(σ)的最佳值。确定最佳SVM参数后,进行100次蒙特卡罗模拟10次交叉验证,计算ROC曲线和PR曲线下的平均面积。

因为对每个胚胎测量总共四个机械参数,所以进行前向特征选择以确定包括在我们的生存力分类器中的最佳参数数量。该过程的结果显示在补充图2C中,表明当使用两个参数而不是一个参数时有很大的改进,并且当添加第三个参数时略有改进。使用所有四个参数会降低分类器的有效性,因为第四个参数对于通过活力分离胚胎没有用,但会为数据增加额外的维度。

为了进行前向特征选择,首先将每个参数单独用于分离胚胎,并找到最佳分类器。如上所述,进行10倍交叉验证以估计该参数的ROC曲线下的面积。一旦选择了具有最高预测值的参数,就使用每个剩余参数训练和优化新的分类器。将导致预测值最大改善的参数添加到分类器中,并且重复该过程直到没有剩余参数。

对于皮质颗粒释放的实验,为了简单起见,仅使用最具可预测性的参数(刚度,k 1)显示了数字。先前训练的三参数分类器用于通过活力对胚胎进行分类,但我们确定仅在使用刚度时数字最清晰。

小鼠活产实验

CD1雌性小鼠购自Jackson Laboratory并与输精管切除的雄性大鼠交配以作为假孕受体。将小鼠保持在与用于胚胎收集的条件相同的条件下。测量从(C57B6xDBA2)F1小鼠收集的胚胎的机械参数,并基于这些参数将胚胎分选成活的或非活的组。在每个实验中,将相同数量的单细胞阶段小鼠胚胎(范围从10到15)转移到最近堵塞的胚胎接受者的输卵管中。该实验重复四次(补充表1)在每个实验中将10-15个胚胎转移到每只小鼠中。转移胚胎的技术人员不知道胚胎在哪一组中。随机选择相同发育阶段的相同数量的胚胎并转移到假孕小鼠作为对照。预计在手术后第20天会出现幼崽。甲χ 2进行-test测试在出生每个组(活的,非存活或控制)的幼鼠数目的差异是否是统计学显著。

RNA-seq样品制备

用总共32个2PN人胚胎进行两个单独的实验以获得RNA-seq的样品。解冻后使胚胎在培养基中恢复3-4小时,并测量机械参数。基于其机械参数将每个胚胎分类为存活或不存活。根据提供者的方案,使用SMARTer Ultra Low RNA试剂盒(Clontech)从总RNA合成来自每个胚胎的cDNA。在Covaris剪切全长cDNA后,使用NEBNext DNA样品制备主混合物组(New England Biolabs)产生最终文库,并用Agilent 2100生物分析仪进行质量控制。然后使用100-bp配对末端测序策略在Illumina HiSeq 2000平台上提交所得样品用于单细胞RNA-seq。

在选择用于测序的25个胚胎中,由于技术困难(未回收RNA)排除了三个胚胎。我们提交了总共22个用于测序的胚胎,基于机械参数将其分类为存活或不存活。

RNA-seq数据处理

测序返回约 10亿个长度为101的配对末端读数,总共22个胚胎。以fastq格式的原始序列数据通过质量控制以去除低质量碱基调用和适配器序列(FastX修剪器和限幅器)。然后用计算机上的STAR对准器工具67将过滤的序列与参考人类基因组(hg18)比对。对得到的.bam文件进行过滤以获得对齐质量,排序并删除PCR重复(SAMtools sort和rmdup)。然后使用HTSeq计数68计算每个基因的计数,并将比对的读数与参考人转录组进行比较。

为了解释由于患者之间的生物学差异,不同的冷冻方案,培养基或其他因素引起的可能的批次效应,我们必须确定哪些胚胎来自哪些患者。我们分析了每个胚胎的转录组中的序列变体,并对我们具有良好测序覆盖度的变体进行了层次聚类(补充图11)。我们确定在22个测序的胚胎中,17个具有'兄弟'胚胎,而5个是来自各自患者的唯一胚胎。我们排除这五个,然后在广电使用的作战功能69,70在R中包装以从剩余的17个胚胎的RNA-seq数据中去除批次效应。尽管排除没有兄弟姐妹的五个胚胎可能会使我们的结果产生偏差,但仅使用一个样本就无法估计这些患者的生物学差异,因此我们不得不将它们排除在外。在去除这些批次效应后,我们的数据反映了所有患者中存活和不存活的胚胎之间的母系遗传转录物的差异。使用R package edgeR 28对调整后的数据进行差异表达分析。具有q值的基因(通过Benjamini-Hochberg方法调整的P值)小于0.01被归类为具有统计学意义的基因。

基因本体和网络分析

将q值 <0.01 的DE基因列表传递到DAVID工具(NCBI)中,并且使用与BP和分子功能(MF)相关的本体术语进行聚类。具有至少一个具有调整的P值<0.05的术语的簇被认为是统计学上显着的并且包括在表1中。每个群集中的术语合并为一个描述性短语,并包含在表1中。使用R中的goseq和GO.db包进行进一步的基因本体分析。所有具有至少10个基因的基因本体类别按该类别中基因DE的百分比的顺序排列,并与所有基因DE的比例进行比较。类别。

IPA用于分析DE基因列表以及活的和不存活的胚胎之间的对数倍变化。进行核心分析以发现基于基因表达变化以及作为一组调节的基因网络预测显着增加或减少的细胞过程。

皮质颗粒染色

在两个单独的实验中在合子阶段测量来自B6小鼠的胚胎和来自IVF(来自CBA小鼠)的胚胎的机械参数。基于其机械参数将胚胎分类为存活或不存活,然后通过将胚胎短暂暴露于Tyrode溶液(Sigma)然后在PBS(Invitrogen)中洗涤三次来除去ZP。然后将脱落的胚胎在4%多聚甲醛中在室温下固定20分钟,并用异硫氰酸荧光素标记的凝集素抗体(Sigma)和4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色。Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜用于可视化和图像捕获。

共聚焦图像处理

将原始图像堆栈转换为TIFF格式,并编写自定义Matlab脚本以提取图像参数。对每个堆叠中的所有图像进行对比度调整以解决在较大成像深度处的信号损失,并计算每个堆叠的投影图像。通过使用Otsu方法,Canny边缘检测和圆形霍夫变换进行自动阈值分离来分离每个细胞的细胞质,以检测每个细胞的位置和大小。沿着围绕每个细胞的圆周的路径计算强度分布,在细胞半径的95%处,并且具有10%的细胞半径的宽度。图像4中绘制的参数是(a)该强度分布的平均值和(b)sd。

统计测试

甲χ 2 -test用于测试是否导致活产的胚胎的比例(第2.2节)是三个实验组之间显著不同(基于力学预测可行的,预测的非存活基于力学和控制排序仅由形态学)。该测试的唯一假设是,没有一组(“组”指的是导致活产的胚胎,或不导致活产的胚胎)包含少于五个样本。对于所进行的两种比较(存活与对照,存活与不存活)均满足该假设。

为了确定在存活和不存活的人胚胎之间具有显着差异的基因,使用R中的sva和edgeR包。这些包已经过很好的验证,可用于去除批次效应并确定RNA-seq数据表达的显着差异。

Wilcoxon秩和检验用于比较胚胎之间的皮质颗粒亮度(未使用t检验,因为样品数量较少且根据Lilliefors检验不正常分布)。为了确定注射IP3抗体是否改变了平均胚胎僵硬度,双侧t使用-test是因为使用Lilliefors检验确定注射抗体和对照注射的组正常分布。使用双样品Kolmogorov-Smirnov检验显示抗体的注射引起刚度值分布的显着变化。Wilcoxon秩和检验用于比较注射抗体和对照注射组的四分位数之间的差异,因为每个四分位数中的样本非常少。Wilcoxon秩和检验也用于测试GV,MI和MII阶段之间卵母细胞僵硬度中值的差异,因为刚度值不符合正常性标准。

公司实力展示
韩晶: 135-3983-5229 李欣: 139-2955-2205 林丽: 138-0298-4966 李谊: 139-2235-2985